第一法 大腸菌群MPN法

1、取樣原則：本標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)應(yīng)的檢樣量分別為0.1g（mL）、0.01g（mL）、0.001g（mL），根據(jù)樣品限量值，查閱附錄部分MPN表：

（1）無(wú)論固體或液體，當(dāng)限量值為“＜3.0”或其它任意能在標(biāo)準(zhǔn)“表1”中查到的數(shù)值，則分別取1mL 1：10的樣品勻液接種到3管單料LST肉湯管、分別取1mL 1：100的樣品勻液接種到3管單料LST肉湯管、分別取1mL 1：1000的樣品勻液接種到3管單料LST肉湯管；

（2）無(wú)論固體或液體樣品的限量值為“＜0.3”或其它任意為MPN表中查到的數(shù)值縮小10倍的數(shù)值，則分別取10mL樣品1:10稀釋液接種到3管雙料LST肉湯管、分別取1mL 1：10的樣品勻液接種到3管單料LST肉湯管、分別取1mL 1：100的樣品勻液接種到3管單料LST肉湯管（如蜂蜜的限量值為0.3MPN/g，即采取此做法）。

2、凡產(chǎn)酸或產(chǎn)氣的LST管，都取1環(huán)接種GBLB肉湯管，凡BGLG產(chǎn)氣者記為陽(yáng)性。

第二法 大腸菌群平板計(jì)數(shù)法

（常見問題匯總）

1、VRBA培養(yǎng)相關(guān)問題
（1）所用器皿是否需要滅菌？
答：不需要。配制培養(yǎng)基所用到的錐形瓶、玻璃棒、勺子等均不需要滅菌，但要求一定要清洗干凈，表面無(wú)污漬、無(wú)殘留。煮沸完成后，取下錐形瓶，用一般常用的衛(wèi)生紙（軟紙）覆蓋瓶口，用橡皮筋纏繞，待冷卻至適宜溫度即可傾注培養(yǎng)基。在傾注培養(yǎng)基時(shí)，須點(diǎn)燃酒精燈，稍微灼燒錐形瓶口。

（2）如何保持“煮沸2min”？
答：可以用電磁爐或電熱板進(jìn)行加熱煮沸，在該培養(yǎng)基即將煮沸時(shí)調(diào)低溫度。實(shí)際操作時(shí)，不需要嚴(yán)格按照此要求進(jìn)行，加熱煮沸數(shù)秒即可。原因：本培養(yǎng)基很難保持煮沸2min，一旦煮沸，則培養(yǎng)基很快上涌、翻騰，若不調(diào)低溫度或立刻采取其他措施，則培養(yǎng)基可在數(shù)秒內(nèi)噴涌出來(lái)，嚴(yán)重者可噴涌2米以上、電磁爐周圍1—2米范圍內(nèi)都是培養(yǎng)基飛濺的范圍（實(shí)驗(yàn)室危險(xiǎn)因子之一）。

（3）若培養(yǎng)基未用完，是否可以冷藏起來(lái)下次用？
答：不可以。4789.28中已規(guī)定，固體培養(yǎng)基最多允許熔融1次（指的是經(jīng)過(guò)高壓滅菌冷卻后的培養(yǎng)基還可以熔融一次后使用）。且VRBA培養(yǎng)基冷卻后，再次熔融時(shí)非常容易噴涌，若溫度控制不當(dāng)，底部培養(yǎng)基熔融后很快就會(huì)發(fā)生噴涌（即培養(yǎng)基未完全熔融就會(huì)發(fā)生噴涌現(xiàn)象）。

（4）傾注完成后是否需要“覆蓋一層”？如何覆蓋？
答：一般情況下不需要覆蓋。在實(shí)際操作過(guò)程中，若檢驗(yàn)員初次接觸該食品（或食品品類），則有必要在傾注培養(yǎng)基后再覆蓋一層（原因是不清楚該樣品是否會(huì)發(fā)生蔓延）。而如此往復(fù)測(cè)試幾次后，若該樣品或食品品類均不存在蔓延現(xiàn)象，則以后的實(shí)驗(yàn)中都不需要進(jìn)行覆蓋。若重復(fù)多次測(cè)試后都有蔓延現(xiàn)象，則以后的檢驗(yàn)中最好都進(jìn)行覆蓋，最好是在原培養(yǎng)基已凝固或半凝固（不會(huì)發(fā)生晃動(dòng)）時(shí)再傾注一層培養(yǎng)基（“一層”是指緩慢傾注培養(yǎng)基至培養(yǎng)基剛好能夠覆蓋整個(gè)平皿）。

2、如何確定培養(yǎng)基上長(zhǎng)的是不是大腸菌群？
答：建議新手們認(rèn)真按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)，此證實(shí)試驗(yàn)簡(jiǎn)單易操作，每一次VRBA上有菌落生長(zhǎng)都進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)，如此往復(fù)3-4次，對(duì)于哪種形態(tài)才是大腸菌群已經(jīng)能夠了然于心。

第二部分、GB/T 4789.3-2003 《大腸菌群測(cè)定》——標(biāo)準(zhǔn)解讀

（標(biāo)準(zhǔn)補(bǔ)充）

1、由于MPN表中給出的檢樣量為1mL（g）、0.1mL（g）0.01mL（g）三個(gè)稀釋度，所以：

（1）無(wú)論固體或液體，當(dāng)限量值為“＜30”或其它任意能在標(biāo)準(zhǔn)“表1”中查到的數(shù)值，則分別取10mL 1：10的樣品勻液接種到3管雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管、分別取1mL 1：10的樣品勻液接種到3管單料乳糖膽鹽發(fā)酵管、分別取1mL 1：100的樣品勻液接種到3管單料乳糖膽鹽發(fā)酵管（有時(shí)限量值≤300，也建議同樣操作）；

（2）若液體樣品的限量值為“＜3”，則分別取10mL樣品原液接種到3管雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管、分別取1mL樣品原液接種到3管單料乳糖膽鹽發(fā)酵管、分別取1mL 1：10的樣品勻液接種到3管單料乳糖膽鹽發(fā)酵管，9管皆為陰性則符合該限量值。

2、大腸菌群在EMB培養(yǎng)基上的典型形態(tài)特征，參考GB 5750-2006中總大腸菌群發(fā)酵法相關(guān)章節(jié)。但仍然建議：一旦有菌落數(shù)生長(zhǎng)，無(wú)論是否為典型形態(tài)，都應(yīng)挑取進(jìn)行革蘭氏染色及證實(shí)試驗(yàn)。

3、最后一次證實(shí)試驗(yàn)，凡乳糖發(fā)酵管產(chǎn)氣（無(wú)論氣泡大�。┣腋锾m氏染色鏡檢為陰性則判定為大腸菌群陽(yáng)性。

以GB 2726-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 熟肉制品》為例，其中大腸菌群指標(biāo)如下：

該標(biāo)準(zhǔn)提到的檢驗(yàn)方法并未寫明是按GB 4789.3-2016中的第一法還是第二法檢測(cè)，那現(xiàn)在按檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)分析一下：

1. GB/T 4789.3-2003的檢測(cè)結(jié)果單位為MPN/100克或MPN/100毫升”

2. GB 4789.3-2016中的第一法中的檢測(cè)單位為“MPN/克或MPN/毫升”

3. GB 4789.3-2016中的第二法檢測(cè)結(jié)果單位為“CFU/克或CFU/毫升”