一、原理
利用氨基酸的兩性作用，加人甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性。用氫氧化鈉標準溶液滴定后定量，以酸度計測定終點。

二、試劑
除非另有說明,本方法所用試劑均為分析純,水為GB/T 6682規(guī)定的三級水。
甲醛(36%~38%):應不含有聚合物(沒有沉淀且溶液不分層)。
酚酞。
乙醇。
鄰苯二甲酸氫鉀:基準物質。

三、試劑配制
氫氧化鈉標準滴定溶液[c(NaOH)-0.050mol/L]:經(jīng)國家認證并授子標準物質證書的標準滴定溶液或配制方法如下：
1、酚酞指示液:稱取酚酞1g溶于95%的乙醇中,用95%乙醇稀釋至100 mL。
2、氫氧化鈉溶液[氯氧化鈉標準滴定溶液c(NaOH)=0.05mol/L]：稱取110g氫氧化鈉于250mL的燒杯中，加100mL的水，振搖使之溶解成飽和溶液，冷卻后置于聚乙烯的塑料瓶中,密塞放置，澄清后備用。取上層清液2.7 mL加適量新煮沸過的冷蒸餾水至1000mL,搖勻。
3、氫氧化鈉標準滴定溶液的標定：準確稱取約0.36g在105℃~110℃干燥至恒重的基準鄰苯二甲酸氫鉀,加80mL新煮沸過的水,使之盡量溶解,加2滴酚酞指示液(10g/L),用氫氧化鈉溶液滴定至溶液呈微紅色,30s不褪色。記下耗用氫氧化鈉溶液毫升數(shù)。同時做空白試驗。
C＝m/( V1— V2)×0.2042………（1）
式中：
c-氫氧化鈉標準滴定溶液的實際濃度。單位為摩爾每升(mol/L)；
m-基準鄰苯二甲酸氫鉀的質量。單位為克(g)；
V1-氯氧化鈉標準溶液的用量體積。單位為毫升(mL)；
V2-空白實驗中氫氧化鈉標準溶液的用量體積。單位為毫升(mL)；
0.2042--與1.00mL氫氧化鈉標準滴定溶液[e(NaOH)=1.000mol/L]相當?shù)幕鶞枢彵蕉姿釟溻浀馁|量。單位為克(g)。
四、儀器和設備
酸度計(附磁力攪拌器)。
10mL微量堿式滴定管。
分析天平:感量0.1mg。

五、分析步驟
1、醬油試樣
稱量5.0g試樣于50mL的燒杯中,用水分數(shù)次洗入100mL容量瓶中,加水至刻度，混勻后吸取20.0mL，置于200ml燒杯中，加60mL水，開動磁力攪拌器，用氫氧化鈉標準溶液[e(NaOH)=0.050mol/L]滴定至酸度計指示pH為8.2，記下消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的毫升數(shù)，可計算總酸含量。加入10.0mL甲醛溶液,混勻。再用氯氧化鈉標準滴定溶液繼續(xù)滴定至pH為9.2，記下消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的毫升數(shù)。同時取80ml水。先用氫氧化鈉標準溶液[e(NaOH)=0.050mol/L]調節(jié)至pH為8.2，再加人10.0mL甲醛溶液.用氫氧化鈉標準滴定溶液滴定至pH為9.2，做試劑空白試驗。
2、醬及黃豆醬樣品
將醬或黃豆醬樣品攪拌均勻后，放入研缽中，在10min內迅速研磨至無肉眼可見顆粒,裝人磨口瓶中備用。用已知重量的稱量瓶稱取攪拌均勻的樣品5.0g用50mL80℃左右的燕餾水分數(shù)次洗入100mL燒杯中，冷卻后，轉人100mL容量瓶中，用少量水分次洗滌燒杯洗液并入容量瓶中并加水至刻度混勻后過能。吸取濾液10.0mL置于200mL燒杯中，加60mL水，開動磁力攪拌器，用氫氧化鈉標準溶液[e(NaOH)=0.050mol/L]滴定至酸度計指示pH為8.2記下消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的毫升數(shù),可計算總酸含量。加人10.0mL甲醛溶液混勻。再用氣氧化鈉標準滴定溶液繼續(xù)滴定至pH為9.2記下消耗氯氧化鈉標準滴定溶液的毫升數(shù)。同時取80mL水，先用氫氧化鈉標準溶液[e(NaOH)=0.050mol/L]調節(jié)至pH為8.2再加入10.0mL甲醛溶液,用氫氧化鈉標準滴定溶液滴定至pH為9.2做試劑空白試驗。

六、分析結果的表述
試樣中氨基酸態(tài)氨的含量按式(2)進行計算:
             X＝(V1— V2)×C×0.014×100/ m× V3/ V4………(2)
式中:
X一 試樣中氨基酸態(tài)氮的含量,單位為克每百克(g/100g)；
V1一測定用試樣稀釋液加入甲醛后消耗氯氧化鈉標準滴定溶液的體積，單位為毫升(mL)；
V2-試劑空白實驗加入甲醛后消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積,單位為毫升(mL)；
C-氫氧化鈉標準滴定溶液的濃度,單位為摩爾每升(mol/L)；
0.014--與1.00mL氫氧化鈉標準滴定溶液[<(NaOH)=1.000mol/L]相當?shù)牡馁|量，單位為克(g)；
m-稱取試樣的質量,單位為克(g)；
V3一試樣稀釋液的取用量,單位為毫升(mL)；
V4一試樣稀釋液的定容體積.單位為毫升(mL)；
100一單位換算系數(shù)。
計算結果保留兩位有效數(shù)字。

七、精密度
在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。

B.第二法、比色法   

一、原理
在pH為4.8的乙酸鈉乙酸緩沖液中，氨基酸態(tài)氣與乙酰丙酮和甲醛反應生成黃色的3.5-二乙酸-2.6-二甲基-1.4二氫化吡啶氨基酸衍生物。在波長400nm處測定吸光度，與標準系列比較定量。

二、試劑和材料
除非另有說明,本方法所用試劑均為分析純,水為GB/T 6682規(guī)定的二級水。
試劑：
乙酸:無水乙酸鈉或乙酸鈉。
甲醇。
乙酰丙酮。

三、試劑配制
乙酸溶液(1mol/L)：量取5.8mL冰乙酸，加水稀釋至100mL。
乙酸鈉溶液(1mol/L)：稱取41g無水乙酸鈉或68g乙酸鈉。加水溶解后并稀釋至500mL。
乙酸鈉乙酸緩沖液：量取60mL乙酸鈉溶液(1mol/L)與40mL乙酸溶液(1mol/L)混合,該溶液pH為4.8。
顯色劑:15mL37%甲醇與7.8mL乙酰丙酮混合,加水稀釋至100mL,劇烈振搖混勻(室溫下放置穩(wěn)定3d)。

四、標準溶液配制
氨氮標準儲備溶液(1.0mg/mL)：精密稱取105℃干燥2h的硫酸銨0.4720g于小燒杯中，加水溶解后移至100mL容量瓶中，并稀釋至刻度，混勻。此溶液每毫升相當于1.0mg氨氮(10℃下冰箱內貯存穩(wěn)定1年以上)。
氨氮標準使用溶液(0.1g/L):用移液管精確量取10mL。氨氮標準儲備液(1.0 mg/mL)于100mL容量瓶內。加水稀釋至刻度,混勻,此溶液每毫升相當于100μg氨氮(10℃下冰箱內貯存穩(wěn)定1個月)。

五、儀器和設備
分光光度計。
電熱恒溫水浴鍋(100℃士0.5℃)。
10mL具塞玻璃比色管。

六、分析步驟
1、試樣前處理
稱量1.00g試樣于50mL容量瓶中,加水稀釋至刻度,混勻。
2、標準曲線的制作
精密吸取氨氮標準使用溶液0 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL分別于10 mL比色管中。向各比色管分別加人4mL乙酸鈉乙酸緩沖溶液(pH4.8)及4mL顯色劑，用水稀釋至刻度,混勻。置于100 ℃水浴中加熱15 min，取出，水浴冷卻至室溫后。移入1cm比色阻內，以零管為參比,于波長400nm處測量吸光度。繪制標準曲線或計算直線回歸方程。
3、試樣的測定
精密吸取2 mL試樣稀釋溶液于10 mL比色管中。加入4 mL乙酸鈉乙酸緩沖溶液(pH4.8)及4 mL顯色劑,用水稀釋至刻度,混勻。置于100℃水浴中加熱15 min.取出,水浴冷卻至室溫后,移入1cm比色皿內，以零管為參比，于波長400nm處測量吸光度。試樣吸光度與標準曲線比較定量或代人標準回歸方程.計算試樣含量。

七、分析結果的表述
試樣中氨基酸態(tài)氮的含量按式進行計算:
                 X＝m×100/ m1×1000×1000× V1/ V2………(3)
式中:
X一試樣中氨基酸態(tài)氮的含量，單位為克每百克(g/100 g)；
m-試樣測定液中氮的質量，單位為微克(μg)；
m1-稱取試樣的質量，單位為克(g)；
V1一測定用試樣溶液體積，單位為毫升(mL)；
V2-試樣前處理中的定容體積，單位為毫升(mL)；

八、精密度
在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。

九、其他
本方法的檢出限為0.0070 mg/100 g。定量限為0.0210 mg/100g。
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