[實驗目的]
1 了解細胞轉(zhuǎn)染技術原理和基本方法
2 磷酸鈣沉淀法的基本技術要點
[實驗原理]
磷酸鈣沉淀法是基于磷酸鈣-DNA復合物的一種將DNA導入真核細胞的轉(zhuǎn)染方法，磷酸鈣被認為有利于促進外源DNA與靶細胞表面的結(jié)合。磷酸鈣-DNA復合物粘附到細胞膜并通過胞飲作用進入靶細胞，被轉(zhuǎn)染的DNA可以整合到靶細胞的染色體中從而產(chǎn)生有不同基因型和表型的穩(wěn)定克隆。這種方法首先由Graham和van der Ebb使用，后由Wigler修改而成。可廣泛用于轉(zhuǎn)染許多不同類型的細胞，不但適用于短暫表達，也可生成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。
[儀器、材料和試劑]
1 呈指數(shù)生長的真核細胞（如HeLa,BALB/c 3T3,NIH 3T3,CHO,或鼠胚胎成纖維細胞）
2 完全培養(yǎng)液（依所用的細胞系而定）
3 CsCl純化的質(zhì)粒DNA （10～50μg/次轉(zhuǎn)染，二次純化）
4 2×HEPES緩沖鹽水(HeBS)
(pH6.95～7.05) 50.0mmol/L HePes;280mmol/L NaCl;10mmol/L KCl;1.5mmol/L葡萄糖。用0.5mmol/L NaOH調(diào)pH至6.95～7.05,過濾除菌后,-20℃保存?zhèn)溆谩?br />5 2.5mol/L CaCl2過濾除菌,-20℃保存?zhèn)溆谩?br />6 磷酸緩沖鹽水（PBS）
7 37℃，5%CO2的加濕培養(yǎng)箱
8 100mm組織培養(yǎng)平板
9 15ml錐形管
[方法與步驟]
1 傳代細胞準備 細胞在轉(zhuǎn)染前24ｈ傳代,待細胞密度達50%～60%滿底時即可進行轉(zhuǎn)染。加入沉淀前3～4h，用9ml完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞。
2 DNA沉淀液的準備 首先將質(zhì)粒DNA用乙醇沉淀（10～50μg/10cm平板），空氣中晾干沉淀，將DNA沉淀重懸于μL無菌水中，加50μL2.5mol/L CaCl2。
3 用巴斯德吸管在500μL 2×HeBS中逐滴加入DNA-CaCl2溶液，同時用另一吸管吹打溶液，直至DNA-CaCl2溶液滴完，整個過程需緩慢進行，至少需持續(xù)1～2min。
4 室溫靜置30min,出現(xiàn)細小顆粒沉淀。
5 將沉淀逐滴均勻加入10cm平板中，輕輕晃動。
6 在標準生長條件下培養(yǎng)細胞4～16h。除去培養(yǎng)液，用5ml 1×HeBS洗細胞2次，加入10ml完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞。
7 收集細胞或分入培養(yǎng)皿中選擇培養(yǎng)。
[注意事項]
1 在整個轉(zhuǎn)染過程中都應無菌操作。
2 為獲得最佳實驗結(jié)果，DNA應不含蛋白質(zhì)和酚。乙醇沉淀后的DNA應保持無菌，并在無菌水或Tris EDTA中溶解。
3 沉淀物的大小和質(zhì)量對于磷酸鈣轉(zhuǎn)染的成功至關重要。在磷酸鹽溶液中加入DNA-CaCl2溶液時需用空氣吹打，以確保形成盡可能細小的沉淀物，因為成團的DNA不能有效地粘附和進入細胞。
4 在實驗中使用的每種試劑都必須小心校準，保證質(zhì)量，因為甚至偏離最優(yōu)條件十分之一個pH都可能導致磷酸鈣轉(zhuǎn)染的失敗。
[參考文獻]
1 Graham, F.L. and Van der Eb, A.J. (1973) Virology 52, 456.
2 Wigler, M., Silverstein, S., Lee, L.S., Pellicer, A., Cheng, Y.C. and Axel, R. (1977) Cell 11, 223.
3 Invitrogen Corporation Calcium Phosphate Transfection Kit Cat. no. K2780-01
4 Invitrogen Corporation Calcium Phosphate Transfection System Cat. no. 18306-019
5 Invitrogen Corporation 陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染指南,2003,(1)
6 顏子穎等譯 精編分子生物學實驗指南 北京:科學技術出版社,1998,274-328
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8 李華等 基因?qū)氲闹|(zhì)體轉(zhuǎn)染法和磷酸鈣轉(zhuǎn)染法之比較,中國實驗動物學雜志,2000,10,(2):65-68