1. 原理：戊二醛為一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價(jià)結(jié)合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結(jié)合物。
2. 標(biāo)記步驟：
(1) 稱取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜。
(2) 反應(yīng)后的酶溶液經(jīng)Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml／1分鐘，收集棕色流出液。如體積大于5ml，則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。
(3) 將待標(biāo)記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。
(4) 用1M PH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續(xù)攪拌3?小時(shí)。
(5) 加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2小時(shí)。
(6) 在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1小時(shí)。
(7) 3000rpm離心半小時(shí)，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
(8) 將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。
3. 結(jié)果判定：
(1) 定性及效價(jià)滴定：用特異性抗原(或抗體)同酶標(biāo)記抗體(或抗免疫球蛋白抗體)作雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)或免疫電泳試驗(yàn)。然后用酶的底物使沉淀弧顯色，可初步鑒定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里)對(duì)酶結(jié)合物進(jìn)行滴定( 見本節(jié) (三)工作濃度的選擇)。
(2) 定量和克分子比值測定：可用分光光度計(jì)測定(光程1cm)。
酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.4
IgG量(mg／ml)＝OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62
酶量(mg／ml) IgG量(mg／ml) 酶量
克分子比值＝──────── ÷ ─────── ＝ ─── × 4
40,000 160,000 IgG量
(3) 本法標(biāo)記步驟比較簡單，重復(fù)性好。缺點(diǎn)是酶的利用率低，一般只有2～4％的酶與蛋白質(zhì)結(jié)合。
(1) 0.1M PH6.8磷酸緩沖鹽水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸餾水至200ml。
(2) 1.25％戊二醛液：取25％戊二醛50ml與PH6.8的PBS1ml混合。
(3) 1M PH9.5碳酸鹽緩沖液：取1M碳酸鈉3ml與1M碳酸氫鈉7ml混合。
(4) 0.2M賴氨酸溶液：稱賴氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸緩沖液1ml中。
(5) 0.15M PH7.4 PBS及生理鹽水。
(6) PH7.8飽和硫酸銨溶液及半飽和硫酸銨溶液。
(7) 萘氏試劑及聚乙二醇(PEG，MW2000)。
(8) 純化的特異性抗體或抗Ig抗體。
(9) HRP(RZ>3.0)。
(10) Sephadex G-25層析柱(2cm×50cm)。
(11) 攪拌器，分光光度計(jì)，離心機(jī)。
(12) 透析袋，大、小燒杯，試管，吸管等。