（一）雙縮脲測定法
1．原理 蛋白質(zhì)中的肽鍵有雙縮脲反應(yīng)，在堿性溶液中與二價銅離子形成藍紫色的絡(luò)合物，在一定的范圍內(nèi)，顏色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比。此法特異性強，游離的氨基酸、小肽和核酸均不產(chǎn)生這種反應(yīng)，但此法不夠敏感，僅能測出毫克水平。
2．試劑配制
硫酸銅（CuSO4·5H2O）
酒石酸鉀鈉
H2O 500.0ml
10％氫氧化鈉（不含硫酸鈉） 300ml
H2O 加至 1 000ml
此溶液可長期保存，如產(chǎn)生暗紅色沉淀，則應(yīng)廢棄重配。
3．標準曲線的制備
⑴ 準確稱取牛血清白蛋白
⑵ 將1％的牛血清白蛋白按表進行稀釋：
表 牛血清白蛋白稀釋方法表
|
成 分 |
試 管 號 |
||||||||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
|
|
1％蛋白液（ml） |
1.0 |
.09 |
0.8 |
0.7 |
0.6 |
0.5 |
0.4 |
0.3 |
0.2 |
0.1 |
－ |
|
蛋白含量（mg） |
10 |
9 |
8 |
7 |
6 |
5 |
4 |
3 |
2 |
1 |
－ |
|
生理鹽水（ml） |
0.5 |
0.6 |
0.7 |
0.8 |
0.9 |
1.0 |
1.1 |
1.2 |
1.3 |
1.4 |
1.5 |
|
雙縮脲試劑（ml） |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
|
試劑蛋白含量（mg） |
8.0 |
7.2 |
6.4 |
5.6 |
4.8 |
4.0 |
3.2 |
2.4 |
1.6 |
0.8 |
0 |
注：1％牛血清白蛋白，經(jīng)凱氏定氮測定含純蛋白為80％。
⑶ 混勻后于室溫放置0.5h～1h，光電比色（540nm），順序由低濃度至高濃度，每管測3次，求其平均值。
⑷ 以OD值為縱坐標，蛋白含量為橫坐標繪制標準曲線。
4．樣品測定
⑴ 取樣品0.1ml，加生理鹽水1.4ml。也可將樣品做1﹕10稀釋加1ml，再加生理鹽水0.5ml。
⑵ 加雙縮脲試劑4.0ml，混勻，至室溫0.5h～1h。
⑶ 另以1.5ml生理鹽水加4.0ml雙縮脲試劑作為空白對照。
⑷ 測OD540值。
⑸ 根據(jù)OD值從標準曲線上查出蛋白含量。
注意：各種雙縮脲試劑的配法、加量及室溫靜置時間均有差異，一旦標準曲線制定后，樣品的測定則必須與標準曲線制定的條件一致，否則結(jié)果有差異。
（二）紫外光譜吸收法
1．原理 本法根據(jù)蛋白之中的芳香族氨基酸－色氨酸、酪氨酸在紫外光區(qū)的吸收特點而建立的。蛋白質(zhì)在280nm波長附近有一吸收峰，其吸收程度與這些氨基酸的含量成正比。此法靈敏度高，可測到微克水平，操作簡單，不需要加各種試劑，測完后，樣品可回收。
2．標準曲線的制備
⑴ 用精密天平稱取牛血清白蛋白50mg，溶于50ml生理鹽水中。
⑵ 以生理鹽水再稀釋成每ml含0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg……0.9mg，以鹽水對照。
⑶ 測各管OD280值。
⑷ 以OD280值為縱坐標，蛋白含量為橫坐標，繪制標準曲線。
3．樣品測定
將待測樣品以鹽水適當稀釋，在0.10mg/ml~1.00mg/ml之間，以生理鹽水為對照，測OD280值，從標準曲線上查出蛋白含量。
（三）Folin酚法
1．原理 蛋白質(zhì)中的酪氨酸與色氨酸和Folin酚試劑中的磷鎢酸、磷鉬酸作用后，在堿性條件下不穩(wěn)定，被還原成藍色的化合物（鉬藍）。因此通過比色即可測知標本中的蛋白含量。該法的優(yōu)點是操作簡單、靈敏度高，且不受溶液中脂多糖的干擾。
2．試劑
試劑甲：
A液：Na2CO3
NaOH
酒石酸鉀鈉（或鉀鹽鈉鹽）
混合、溶于500ml蒸餾水中。
B液：CuSO4·5H2O
H2O 100.00ml
用前將A液50份與B液1份混合即為試劑甲。
試劑乙：
于磨口回流瓶加入下列試劑
Na2WO4·2H2O
NaMoO4·2H2O
H2O 700.00ml
85％H3PO4 50.00ml
濃HCl 100.00ml
按上回流冷凝管以小火回流10h后再加：
硫酸鋰
H2O 50.00ml
溴水 數(shù)滴
開口繼續(xù)沸騰15min，驅(qū)除過量的溴，冷卻后溶液呈黃色微帶綠色（如仍呈綠色，須重復(fù)滴加液體溴步驟）。稀釋至
3．標準曲線的制備
⑴ 取標準牛血清白蛋白2.50mg，溶于10ml蒸餾水中，使成250μg/ml。
⑵ 按表稀釋。
表 標準曲線稀釋方法
|
成分 |
試 管 號 |
||||||||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
|
|
牛血清白蛋白標準品（ml） |
0 |
0.2 |
0.2 |
0.4 |
0.1 |
0.6 |
0.6 |
0.8 |
0.8 |
1.0 |
1.0 |
|
生理鹽水（ml） |
1.0 |
0.8 |
0.8 |
0.6 |
0.6 |
0.4 |
0.4 |
0.2 |
0.2 |
0 |
0 |
|
蛋白含量(μg／ml) |
0 |
50 |
50 |
100 |
100 |
150 |
150 |
200 |
200 |
250 |
250 |
⑶ 每管加試劑甲5ml，混合后室溫放置10min，再加0.50ml試劑乙（即Folin酚試劑），立即搖勻（否則顯色降低）。
⑷ 30min后測OD650nm。
⑸ 以OD為縱坐標，蛋白含量為橫坐標，繪制標準曲線。
4．樣品測定
⑴ 待測樣品1ml（適當稀釋至約含25μg－250μg/ml）。
⑵ 加試劑甲、乙。
⑶ 比色、測OD650值。
⑷ 查標準曲線，求蛋白含量乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的蛋白含量。
（四）紫外分光測定法
A1%
A1%
蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.45OD280－0.74OD260 （此為經(jīng)驗公式，即以不同濃度的蛋白質(zhì)和核酸混合測定的數(shù)值所建立的）。