原理

轉(zhuǎn)移電泳是將經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出的蛋白質(zhì)譜直接轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，而形成固定相，并同時(shí)排除各種干擾物質(zhì)，保持其天然構(gòu)象和生物學(xué)活性，完成在凝膠中難以進(jìn)行的各種生物試驗(yàn)。

材料

1．瓊脂糖

2．丙烯酰胺

3．甲叉雙丙烯酰胺

4．十二烷基磺酸鈉（SDS）

5．硝酸纖維膜濾紙 孔徑0.45μm

6．瓊脂糖凝膠電泳緩沖液 0.89mMol/L Tris—89mmol/L 硼酸—2.5mMol/L EDTA（pH8.3）。

7．SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳緩沖液 0.05Mol/L Tris—0.384Mol/L 甘氨酸—0.1％SDS（pH8.3）。

8．蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移電泳緩沖液 25mMol/L Tris—192mMol/L 甘氨酸—20％甲醇（pH8.3）。

9．溴乙啶溶液 稱取5mg溴乙啶，用無離子水溶解。定容到10ml，取1ml稀釋到1 000ml，最終濃度為0.5ug/ml。

10．考馬斯亮蘭R－250染色液 0.25％考馬斯亮蘭R－250－10％醋酸－45％甲醇。

11．氨基黑染色液 在含10％醋酸的甲醇中加入氨基黑10B至飽和。

12．垂直板型及水平板型凝膠電泳槽

13．轉(zhuǎn)移電泳槽

14．直流穩(wěn)壓電源0V~800V，0mA~100mA

操作方法

1．SDS—聚丙稀酰胺凝膠電泳（垂直板型）分離蛋白質(zhì)。

⑴凝膠的制備：

丙烯酰胺 15.00g

甲叉雙丙烯酰胺 0.40g

0.37Mol/L Tris—HCl（pH8.3） 50ml

此為丙烯酰胺母液，過濾后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

丙烯酰胺母液 8.30ml

N、N、N、N—四甲基乙二胺（DEMED） 250ul

10％SDS 0.25ml

0.375Mol/L pH8.8 Tris－HCl 16.45ml

混合即為10％分離膠。

丙烯酰胺母液 1.30ml

TEMED 15.00ul

10％SDS 0.10ml

0.125Mol/L pH6.8Tris－HCl 8.60ml

制成4％濃縮膠。

將分離膠與濃縮膠真空抽氣10min~15min，備用。

⑵凝膠板的制備及加樣：取1％的瓊脂將凝膠膜底部的縫隙封固。在10％的分離膠中加入10％過硫酸銨0.25ml，混勻后，立即沿玻璃壁緩緩加入膠膜中，上端留出5cm的高度，然后用帶有細(xì)針頭的注射器輕輕地向膠面加入蒸餾水，靜置數(shù)分鐘，水膠界面消失，約20min～30min界面清晰（凝膠已聚合），用注射器將水吸出，并用濾紙吸干余水。在4％濃縮膠中加入10％過硫酸銨0.4ml，混勻后，沿玻璃壁緩慢倒入已聚合的分離膠的上面，立即插進(jìn)樣品槽模板。待凝膠聚合后（約20min～30min），輕輕拔出樣品槽模板。將電泳緩沖液加入上、下電泳槽。

將分離的蛋白質(zhì)樣品用0.01Mol/L Tris－HCl（pH8.0）－0.001Mol/L EDTA－1％SDS－5％硫基乙醇溶液作1︰1稀釋，100℃加熱處理3min之后，加入甘油10％及適當(dāng)量溴酚蘭，用微量注射器將樣品注入樣品槽中，蛋白質(zhì)最后濃度一般為0.05mg／ml～1mg／ml。

⑶電泳：上端接陰極，下端接陽極。電壓120V、電流30mA，電泳時(shí)間5h~6h，待染料泳至距底部約1cm處時(shí)斷電。

⑷染色：切下一部分凝膠，用考馬斯亮蘭R－250染色作為對(duì)照。其余部分作轉(zhuǎn)移電泳。