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        免疫酶組化法(豬瘟組化法)

        放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28

        材料與試劑

        1.α-萘酚液

        α一苯酚 1.00g

        40%乙醇 100.00ml

        3%H2O2 0.20ml

        混合即可,現(xiàn)用現(xiàn)配。

        2.派洛寧液

        派洛寧(Pyroming) 0.10g

        苯胺(Aniline) 4.00g

        40%乙醇 96.00ml

        3.內(nèi)源性酶抑制劑:0.01%H2O2的0.01%的疊氮鈉溶液。

        1%H2 O2 1.00ml

        1%Na N3 1.00ml

        0.015mol/L pH 7.4 PBS液 100.00ml

        4.0.05Mol/L pH 7.6 Tris-HCl緩沖液

        A液:0.2mol/L Tris液

        三羥甲基氨基甲烷 2.43g

        H2 O 100.00ml

        B液:0.1mol/L HCl

        取A液25ml,B液38.9ml,混合,加蒸餾水至100ml即可。

        5.DAB液(Karnovsky液)

        0.05Mol/L pH 7.6 Tris-HCl緩沖液 100.00ml

        3,3-二胺基聯(lián)苯胺鹽酸鹽 76mg

        1% H2 O2 0.5ml

        配后立即使用。

        6.0.10Mol/L pH7.4 PBS液。


        操作方法

        1.豬瘟酶標(biāo)抗體工作滴度的確定 對組化法來說,最簡單的確定工作滴度的方法是將酶標(biāo)抗體進(jìn)行一系列的倍比稀釋,然后對已知陽性標(biāo)本片進(jìn)行染色,以最為清晰的陽性結(jié)果的最大稀釋倍數(shù)或稍提高1~2滴度作為工作滴度。

        購買商品豬瘟酶標(biāo)抗體,則按其說明的工作濃度稀釋即可。

        2.待檢標(biāo)本片的制作 取可疑豬瘟病豬尸體或急宰病豬立即剖檢,采取腎臟、脾臟、淋巴結(jié)等臟器進(jìn)行觸片(或涂片)或冷凍切片(4µm厚度)。余下組織低溫冰箱保存或放于盛有50%甘油鹽水中于普通冰箱保存,以備復(fù)檢或比較用。也可采病豬之血作血球粥片。標(biāo)本片干后,立即以4℃的丙酮液固定15min。固定后的標(biāo)本片可貯藏于4℃冰箱中備用。

        3.染色方法 采用單染法和復(fù)染法均可,萘酚復(fù)染法操作過程:

        ⑴ γ-苯酚液染色4min~5min。

        ⑵ 0.015Mol/L pH7.4 PBS液沖洗10min。

        ⑶ 派洛寧液染2min。

        ⑷ PBS沖洗后,用吸水紙吸除水滴。

        ⑸ 滴加工作濃度的酶標(biāo)抗體液,以復(fù)蓋為度,置濕盒內(nèi)37℃溫育30min~45min,PBS液沖洗。

        ⑹ 加DAB液室溫染色30min;

        ⑺ PBS液沖洗后,餾水中漂洗;

        ⑻ 干燥后,無水酒精脫水5min,二甲苯透明5min,加拿大膠封片。

        DAB單染法:

        ⑴ 滴加內(nèi)源性酶抑制劑30min。

        ⑵ 0.015Mol/L pH 7.4 PBS沖洗液10min。

        以下步驟同復(fù)染法⑸~⑻。

        2.對照組的設(shè)置:首次染色時(shí),應(yīng)設(shè)立如下對照。

        ⑴ 已知陽性標(biāo)本的對照。

        ⑵ 已知陰性標(biāo)本的對照。

        ⑶ 抗體抑制試驗(yàn)對照,即在標(biāo)本上加有與酶標(biāo)抗體來源不同的另一個體的抗豬瘟抗體處理(37℃作用45min)。再以酶標(biāo)抗體染色應(yīng)為陰性。

        ⑷ DAB-H2O2底物染色對照,即不加酶抗體,只加DAB-H2O2液。以檢查內(nèi)源性酶被抑制的情況。


        結(jié)果判定

        在對照組成立的前提下,α-萘酚復(fù)染法:在細(xì)胞漿內(nèi)酶標(biāo)抗體抗原復(fù)合物呈黃褐色,內(nèi)源性酶被染成紅色,背景為淺棕色;單染法:在細(xì)胞漿內(nèi),酶標(biāo)抗體抗原復(fù)合物呈黃褐色,背景成淡黃色或無色。


        注意事項(xiàng)

        1.標(biāo)本必須新鮮,否則非特異性反應(yīng)重。

        2.固定劑的選擇應(yīng)以不影響抗原的活性又不妨礙抗體進(jìn)入細(xì)胞為原則。病毒標(biāo)本的固定劑一般選用冷甲醇和丙酮。

        3.消除內(nèi)源性酶的辦法:

        ⑴ 以0.30%~3%H2O2液室溫處理標(biāo)本15min~30min;

        ⑵ 0.10%苯肼37℃處理1h;

        ⑶ 0.074%鹽酸乙醇液(100ml乙醇含0.20ml濃鹽酸),室溫處理15min。

        4.消除背景染色的辦法 背景染色可以是特異性的,因?yàn)榧?xì)胞漿的外溢和炎性浸潤造成。但大量的是非特異性的,主要是由于組織成分對免疫球蛋白的非特異性吸附所致,可以采用以下辦法消除。

        ⑴ 切片以0.30%~3% H2O2作用后,再以10%卵蛋白作用30min。

        ⑵ 以0.05%吐溫-20和含有0.10%牛血清白蛋白的PBS液預(yù)處理。

        如果采用間接法測定抗原,則可采用下法來消除背景的染色。

        ⑶ 以與第一血清不同種類的正常動物血清做預(yù)處理。

        ⑷ 用來自于酶標(biāo)記第二抗體的同種動物的血清做預(yù)處理,也可用這種血清來稀釋第一抗體。

        5.抗體濃度和酶標(biāo)抗體濃度的確定 直接法測定的酶標(biāo)抗體濃度是以不同梯度的稀釋經(jīng)過試驗(yàn)而定。間接法測定的第一抗體濃度和第二酶標(biāo)抗體濃度的確定,則必須進(jìn)行雙方陣試驗(yàn)預(yù)以選擇。抗體濃度和酶標(biāo)抗體濃度的確定均不宜過高或過低。過高易出現(xiàn)非特異性反應(yīng),過低則影響檢出的敏感性。

         

         

         
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