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1、我的細胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？
答：有沉淀可能因為你的蛋白沒有變性全，可以適當(dāng)提高SDS 濃度，同時將樣品煮沸時間延長； 也不排除你的抗原濃度過高，這時再加入適量上樣緩沖液即可。
2、我做的蛋白質(zhì)分子量很�。�10kd），請問怎么做WB？
答：可以選擇0.2μm的膜，同時縮短轉(zhuǎn)移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。
3、最后顯色時用 DAB好還是ECM好？
答：DAB有毒，但是比較靈敏，是HRP最敏感的底物；ECM結(jié)果容易控制，但被催化時靈敏度差一點，但如果達到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級蛋白，具體可以根據(jù)你實驗的情況。
4、要驗證某個細胞上有無該蛋白的存在，需要做免疫組化和Western Blot試驗嗎？做這兩個試驗時的一抗和二抗可以共用嗎？
答：
①免疫組化可以用來進行定位，但是不能精確定量，而且有時會有假陽性，不易與背景區(qū)分；Western blot可以特異性檢測某個蛋白質(zhì)分子，進行定 量，但是不能定位。
②兩種實驗的一抗有時候不能通用，公司的產(chǎn)品說明一般都會說明可以進行什么實驗，在免疫組化時，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。
5、細胞水平要做Western Blot，多少細胞提的蛋白夠做Western Blot？
答：一般5×106就足夠了。
6、同一樣品能同時提RNA又提蛋白么？這樣對Western Blot有無影響？
答：能，沒有問題。
7、同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的Western Blot檢測嗎？
答：當(dāng)然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品。
8、蛋白變性后可以存放多久？
答：－80℃，一兩年沒有問題。最關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細菌消化掉（也是被酶水解了）。
9、二抗是生物素化的抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調(diào)整，能否再用5％的脫脂奶粉呢？
答：不能使用脫脂奶粉，因為脫脂奶粉中含生物素，用BSA代替應(yīng)該好一點。
10、做組織樣品的Western Blot的時候，怎樣處理樣品？
答：必須進行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點就是組織中的蛋白酶活性更強，需要注意抑制蛋白酶的活性。
11、免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？
答：免疫組化時抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western，而如果抗體識別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。
12、在做Western Blot時，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？
答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時多加甲醇也是這個目的。
13、檢測同一抗體的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一張膜上嗎？
答：可以。
14、蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分離小21kd，中至66kd，大至170kd，可以一次做好嗎？
答：這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移，一般建議：21kd和66kd可以一起轉(zhuǎn)，12％SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)120mA， 45-60min就可以了， 可以根據(jù)你實驗室的經(jīng)驗調(diào)節(jié)；170kd 用 7% SDS－PAGE，200mA 90-120min。
15、細胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什么原則嗎？受不受組織來源的影響？胞膜和胞漿有區(qū)別嗎？
答：一般來說提取時加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時保持低溫。若有特殊要求可以選擇相應(yīng)的蛋白酶抑制劑。
