核心靈魂：無(wú)菌操作

無(wú)論進(jìn)行哪種操作，無(wú)菌操作都是貫穿始終的鐵律。所有操作需在酒精燈火焰附近的無(wú)菌區(qū)進(jìn)行：

培養(yǎng)皿、培養(yǎng)基、工具預(yù)先滅菌。

操作前雙手、臺(tái)面嚴(yán)格消毒。

試管、培養(yǎng)皿開啟或關(guān)閉時(shí)，管口/皿蓋需快速掠過(guò)火焰。

使用后接種環(huán)/涂布棒必須徹底灼燒滅菌，避免交叉污染。

目的： 將熔化的固體培養(yǎng)基無(wú)菌傾倒入培養(yǎng)皿，冷卻凝固形成均勻平板，為后續(xù)接種提供生長(zhǎng)基底。

關(guān)鍵材料：

已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基（加熱熔化并冷卻至約45-50℃，手感溫?zé)岬�不燙手）。

滅菌的培養(yǎng)皿。

操作步驟：

1、準(zhǔn)備： 點(diǎn)燃酒精燈，在火焰旁的無(wú)菌區(qū)操作。取出滅菌培養(yǎng)皿，皿蓋微開置于一側(cè)。

2、取培養(yǎng)基： 手持熔化并冷卻至適宜溫度的培養(yǎng)基試管（如三角瓶），在火焰上灼燒管口和蓋子。

3、傾倒： 將試管口靠近火焰，打開蓋子，迅速將適量培養(yǎng)基（約15-20mL，鋪滿皿底形成適當(dāng)厚度）傾倒入培養(yǎng)皿底部。傾倒時(shí)避免培養(yǎng)基沾到皿蓋或皿壁上緣。

4、覆蓋與冷卻： 立即蓋上皿蓋，輕輕水平旋轉(zhuǎn)或前后左右傾斜培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻鋪滿皿底。

5、凝固： 靜置在水平臺(tái)面上，待瓊脂完全凝固（通常室溫下10-15分鐘）。

6、標(biāo)記與儲(chǔ)存： 在皿底標(biāo)記培養(yǎng)基名稱、日期等信息。凝固后若暫時(shí)不用，可倒置（防止冷凝水滴落）于4℃冰箱保存。

關(guān)鍵點(diǎn)與常見問題：

溫度： 培養(yǎng)基過(guò)熱（>55℃）易產(chǎn)生過(guò)多冷凝水或燙死后續(xù)接種的微生物；過(guò)冷（<45℃）則易凝固無(wú)法倒平或產(chǎn)生凝塊。

厚度： 太薄易干裂，太厚影響觀察和分離效果。

均勻性： 旋轉(zhuǎn)/傾斜務(wù)必輕柔，確保厚度一致。

冷凝水： 倒好的平板常有冷凝水，使用前可倒置于37℃培養(yǎng)箱短時(shí)烘干（約30分鐘）。

應(yīng)用： 制備用于劃線分離、涂布、點(diǎn)種或傾注培養(yǎng)的固體平板。

目的： 利用分區(qū)劃線技術(shù)，將混合菌樣或含菌樣品在平板上進(jìn)行梯度稀釋，最終分離得到單個(gè)、孤立的菌落（純培養(yǎng)物）。

關(guān)鍵材料：

制備好的無(wú)菌固體平板。

接種環(huán)（鉑金或鎳鉻絲）。

菌種（斜面培養(yǎng)物、液體培養(yǎng)物或樣品懸液）。

操作步驟：

1、滅菌接種環(huán)： 手持接種環(huán)，將金屬環(huán)部分置于酒精燈外焰徹底燒紅，再灼燒可能進(jìn)入試管的金屬桿部分，冷卻（可接觸無(wú)菌瓊脂或空氣中靜置數(shù)秒）。

2、取樣： 灼燒菌種管口，用冷卻的接種環(huán)蘸取少量菌樣。若為液體樣品，需確保環(huán)內(nèi)形成菌膜但不滴落。

3、第一次劃線（A區(qū)）：

左手持平板，開啟約30度角（避免空氣中雜菌落入）。

將沾菌的接種環(huán)在平板邊緣約1/4區(qū)域（A區(qū)）輕輕、密集地“之”字形劃線數(shù)次，約占平板面積的1/4-1/3。劃線時(shí)環(huán)與平板表面呈約30度角，輕柔接觸，避免劃破瓊脂。

4、滅菌接種環(huán)： 灼燒接種環(huán)至紅熱，冷卻。

5、第二次劃線（B區(qū)）：

將冷卻環(huán)接觸A區(qū)末端劃線的1-2次，然后在緊鄰A區(qū)的空白區(qū)域（B區(qū)）劃線。劃線范圍約占剩余面積的1/2，劃線方向與A區(qū)有一定交叉（如垂直或斜交），線條間留有間隙。

6、滅菌接種環(huán)與后續(xù)劃線（C/D區(qū)）：

再次灼燒接種環(huán)，冷卻。

接觸B區(qū)末端1-2次，在剩余空白區(qū)域（C區(qū)）劃線。線條更稀疏，覆蓋剩余大部分面積。

如需進(jìn)一步稀釋（樣品含菌量高），可灼燒后劃最后一個(gè)D區(qū)。

7、完成： 蓋上皿蓋，灼燒接種環(huán)。標(biāo)記平板（樣品信息、日期、操作者）。

8、培養(yǎng)： 倒置于適宜溫度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

關(guān)鍵點(diǎn)與常見問題：

冷卻： 接種環(huán)必須充分冷卻再取菌/劃線，否則會(huì)燙死微生物。

分區(qū)與稀釋： A區(qū)要密，后續(xù)區(qū)域逐漸稀疏并接觸前一區(qū)末端，實(shí)現(xiàn)有效稀釋。

角度與力度： 保持適當(dāng)角度，輕柔接觸表面，避免劃破瓊脂。

滅菌： 每劃完一個(gè)區(qū)域必須徹底滅菌接種環(huán)，是分離成功的關(guān)鍵。

單菌落： 理想狀態(tài)是在C區(qū)或D區(qū)獲得分散良好的單菌落。

應(yīng)用： 從混合樣品中分離純化單菌落，是獲取純培養(yǎng)物的最常用方法。

目的： 將一定體積的含菌液體樣品（或稀釋液）均勻涂布在已凝固的平板表面，主要用于活菌計(jì)數(shù)或需要菌苔均勻生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)。

關(guān)鍵材料：

制備好的無(wú)菌固體平板（表面需干燥，無(wú)過(guò)多冷凝水）。

含菌液體樣品（常為系列稀釋液）。

滅菌的玻璃涂布棒（L型彎頭）或一次性塑料涂布棒。

微量移液器及滅菌槍頭。

操作步驟：

1、樣品準(zhǔn)備： 準(zhǔn)備好適當(dāng)稀釋度的含菌液體樣品。

2、加樣： 用移液器吸取一定體積（通常0.1mL或0.2mL）的樣品，輕輕滴加在平板中央。

3、滅菌涂布棒： 將涂布棒浸入70%酒精中，取出后在酒精燈火焰上引燃（無(wú)需燒紅），燃盡酒精后稍冷卻幾秒（或酒精灼燒后待酒精揮發(fā)完）。

4、涂布：

左手持平板，開啟小角度。

將滅菌冷卻的涂布棒接觸平板邊緣無(wú)培養(yǎng)基處（吸走多余酒精/降溫）。

將涂布棒輕輕置于平板中央的液滴上，先不移動(dòng)，讓液體被瓊脂吸收片刻。

快速、輕柔地旋轉(zhuǎn)平板（或用涂布棒作放射狀、同心圓運(yùn)動(dòng)），同時(shí)用涂布棒將液體均勻地涂布至整個(gè)平板表面。確保樣品覆蓋所有區(qū)域，且液體被瓊脂充分吸收。

5、完成： 蓋上皿蓋。涂布棒重新浸入酒精中消毒。標(biāo)記平板（樣品、稀釋度、體積、日期）。

6、干燥與培養(yǎng)： 靜置數(shù)分鐘待表面液體完全吸收（或倒置于培養(yǎng)箱短時(shí)烘干），然后倒置培養(yǎng)。

平板干燥： 表面冷凝水過(guò)多會(huì)稀釋樣品或?qū)е戮�落蔓延。使用前需干燥處理�?/span>

涂布棒滅菌與冷卻： 必須充分滅菌，并適當(dāng)冷卻，避免燙死微生物。酒精灼燒法高效常用。

涂布技巧： 動(dòng)作要快而輕柔，確保樣品均勻分布，不劃破瓊脂。避免液體濺到皿蓋或邊緣。

加樣體積： 通常0.1-0.2mL，過(guò)多不易涂勻且影響吸收。

靜置吸收： 加樣后稍等再涂布，有助于液體滲入瓊脂，減少流動(dòng)。

應(yīng)用： 主要用于菌落計(jì)數(shù)（計(jì)算每毫升樣品中的活菌數(shù) - CFU/mL）、抗生素敏感性試驗(yàn)（紙片法/K-B法）、需要菌苔均勻生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)（如噬菌體效價(jià)測(cè)定）。

注意事項(xiàng)：

安全第一： 嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室生物安全規(guī)范。處理未知或潛在致病微生物應(yīng)在相應(yīng)等級(jí)（BSL-1/2）生物安全柜中進(jìn)行。廢棄物（如污染平板、槍頭）必須按生物危害廢棄物處理。

溫度敏感性： 倒平板溫度、過(guò)熱接種環(huán)對(duì)微生物的殺傷是關(guān)鍵控制點(diǎn)。

耐心與練習(xí)： 無(wú)菌操作和劃線/涂布技巧需要反復(fù)練習(xí)才能熟練掌握。失敗是常事，分析原因（污染？劃線不當(dāng)？涂布不均？）是進(jìn)步的階梯。

記錄： 詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)步驟、樣品信息、稀釋度、培養(yǎng)條件等至關(guān)重要。

倒平板、劃平板與涂布操作，是打開微生物世界大門的三把鑰匙。通過(guò)不斷磨礪這些基礎(chǔ)技藝，研究者得以分離出純凈的菌株，精確量化微生物群體，為后續(xù)的鑒定、生理生化研究及更深入的探索鋪平道路。掌握其精髓，方能在這肉眼不可見的王國(guó)里游刃有余。