真核細(xì)胞的mRNA分子最顯著的結(jié)構(gòu)特征是具有5’端帽子結(jié)構(gòu)（m7G）和3’端的Poly(A)尾巴。絕大多數(shù)哺乳類動物細(xì)胞mRNA的3’端存在20-30個腺苷酸組成的Poly（A）尾，通常用Poly（A ）表示。這種結(jié)構(gòu)為真核mRNA的提取，提供了極為方便的選擇性標(biāo)志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎(chǔ)就在于此。
mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規(guī)方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A ）的特點，在RNA流經(jīng)寡聚（dT）纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結(jié)合在柱上，當(dāng)逐漸降低鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經(jīng)過兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。
寡聚(dT)纖維素柱純化mRNA
一、試劑準(zhǔn)備
1．3M醋酸鈉（pH 5.2）
2．0.1M NaOH
3．1×上樣緩沖液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸鈉。配制時可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，經(jīng)高壓消毒后按各成分確切含量，經(jīng)混合后再高壓消毒，冷卻至65℃時，加入經(jīng)65℃溫育（30min）的10%SLS至終濃度為0.1%。
4．洗脫緩沖液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS
5．無水乙醇、70%乙醇
6．DEPC
二、操作步驟
1．將0.5-1.0g寡聚（dT）-纖維懸浮于0.1M的NaOH溶液中。
2．用DEPC處理的1ml注射器或適當(dāng)?shù)奈�，將寡聚（dT）-纖維素裝柱0.5-1ml，用3倍柱床體積的DEPC H2O洗柱。
3．使用1×上樣緩沖液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。
4．將RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中溫育10min左右，冷卻至室溫后加入等體2×上樣緩沖液，混勻后上柱，立即收集流出液。當(dāng)RNA上樣液全部進入柱床后，再用1×上樣緩沖液洗柱，繼續(xù)收集流出液。
5．將所有流出液于65℃加熱5min，冷卻至室溫后再次上柱，收集流出液。
6．用5-10倍柱床體積的1×上樣緩沖液洗柱，每管1ml分部收集，OD260測定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其內(nèi)含物為無Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或無吸收。
7．用2-3倍柱容積的洗脫緩沖液洗脫Poly(A )RNA，分部收集，每部分為1/3-1/2柱體積。
8．OD260測定Poly(A )RNA分布，合并含Poly(A )RNA的收集管，加入1/10體積3M NaAc（pH5.2）、2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，混勻，-20℃放置30min。
9．4℃離心，10000g×15min，小心吸棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀。[注意：此時Poly(A )RNA的沉淀往往看不到]。4℃離心，10000g×5min，棄上清，室溫晾干。
10. 用適量的DEPC H2O溶解RNA。
三、注意事項
1．整個實驗過程必須防止Rnase的污染。
2．步驟（4）中將RNA溶液置65℃中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個，一個是破壞RNA的二級結(jié)構(gòu)，尤其是mRNA Poly(A )尾處的二級結(jié)構(gòu)，使Poly(A )尾充分暴露，從而提高Poly(A )RNA的回收率；另一個目的是能解離mRNA與rRNA的結(jié)合，否則會導(dǎo)致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。
3．十二烷基肌氨酸鈉鹽在18℃以下溶解度下降，會阻礙柱內(nèi)液體流動，若室溫低于18℃最好用LiCl替代NaCl。
4．寡聚（dT）-纖維素柱可在4℃貯存，反復(fù)使用。每次使用前應(yīng)該依次用NaOH、滅菌 ddH2O、上樣緩沖液洗柱。
5．一般而言，107哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞能提取1-5μg Poly(A )RNA，約相當(dāng)于上柱總RNA量的1%-2%。
